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基因敲入细胞
基因定点敲入（KI，gene knock in）技术是指在细胞基因组特定位点精准敲入外源基因序列，使其在细胞内稳定表达的一种基因编辑技术。
服务详情
| 细胞类型 | 各种细胞类型，包括肿瘤、常规、干细胞、原代和永生化细胞系。 |
|---|---|
| 服务类型 | 荧光蛋白定点敲入（EFGP、Luc、mCherry等）/ 标签蛋白定点敲入（Flag、HA、Myc、HiBiT等）/ 特定位点敲入 / 基因点突变 |
| 交付标准 | 基因敲入单克隆细胞1株（2管细胞，1×10^6/管） |
| 周期/价格 |
快至8周，16800元起  在线咨询 |
技术原理
DNA双链断裂（DSB）是基因敲入的关键步骤，这一损伤会触发细胞中的两种DNA修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。基因敲入技术的核心是gRNA或crRNA引导Cas酶切割目标位点的DNA双链，细胞利用外源给予的Donor为模板，基于HDR或NHEJ机制将目标基因序列精确地敲入到基因组的特定位置。
| 技术类型 | 效率 | 优点 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| CRISPR/HDR | 5-30% | 灵活性高，支持点突变和片段插入 | 分裂较活跃细胞 |
| CRISPaint | 20-50% | 不依赖细胞周期 | 分裂周期长的细胞 |
| Bingo™ | 30-80% | 无DSB或供体模板，脱靶风险低 | 精准敲入小片段或点突变修复 |
| HES-KI | 40%-90% | 独特筛选机制介导高效敲入 | 重要基因位点C端敲入 |
应用范围
● 工业生产：目的基因表达高稳定性和均一性，保障了产品大规模生产的产量和质量。
● 基因治疗：确保细胞治疗中治疗性基因的稳定整合。
● 干细胞工程：在IPSC中实现了高效率的转基因敲入。
● 功能基因组学：筛选必需基因的功能域或调控元件。
● 疾病建模：构建符合生理表达水平的基因修饰细胞系。
HES-KI技术
HES-KI技术原理
HES-KI（重要基因位点敲入）是一种新型的敲入技术，顺利获得在重要基因的C端外显子区域进行CRISPR编辑，并设计一个转基因敲入模板，使得成功敲入的细胞能够恢复重要基因的功能，同时整合敲入的基因序列；如果未成功敲入细胞，如NHEJ介导的有插入或缺失（indels）的细胞，将导致重要基因功能丧失，使细胞无法存活，从而实现对成功敲入细胞的富集。
HES-KI技术优势
高效率
稳定且均一
多基因整合
调控能力强
HES-KI成功案例
• 使用HES-KI技术在K562细胞GAPDH中敲入EGFP，未使用抗性筛选情况下多克隆的敲入效率达到37%
• K562 EGFP-KI细胞和WT细胞单克隆细胞株倍增时间差异不显著，EGFP插入后不影响K562细胞生长。
| K562 EGFP-KI 多克隆 | |
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| K562 EGFP-KI 单克隆 | |
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• 使用HES-KI技术，293T多克隆细胞中，EGFP的敲入效率达到68%。在CHO-K1多克隆细胞中，EGFP的敲入效率达到55%。
• 293T和CHO-K1 EGFP-KI多克隆细胞图片
| 293T | CHO-K1 |
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CRISPaint基因敲入
CRISPaint技术原理
CRISPaint是一种基于CRISPR-Cas9系统的基因敲入技术，顺利获得利用细胞自身的非同源末端连接（NHEJ）修复机制，能够在指定的基因C端位置敲入外源DNA片段，无需依赖同源重组（HDR）。CRISPaint的设计具有高度的灵活性，适用于多种基因功能研究和基因组编辑应用。1、CRISPR-Cas9引导的双链断裂（DSB）
Target sgRNA质粒：切割基因特定位置，导致DNA双链断裂，激活细胞的DNA修复机制。
2、通用Donor载体设计
CRISPaint使用一种通用的供体DNA模板，顺利获得以下组分实现CRISPaint系统灵活的敲入策略：
Frame sgRNA质粒：切割Donor质粒，在细胞内形成线性化模版；有3种Frame-sgRNA可供选择，保证敲入基因正确OFR序列表达。
通用Donor质粒：包含待插入的基因序列（如荧光蛋白）和3种Donor-sgRNA的靶点序列。
3、非同源末端连接（NHEJ）
靶点基因形成DSB和Donor被切割，细胞顺利获得NHEJ修复机制，将线性化的Donor模版整合至DSB位置，实现了高效的基因敲入。
CRISPaint技术优势
高效性
适用范围广
灵活性
CRISPaint实验流程
CRISPaint成功案例
• Sanger测序验证Neo精确敲入至H9细胞A基因C端
Bingo™介导基因敲入
Bingo™技术原理
Bingo™ 是一种基于Prime Editing介导小片段敲入的基因编辑技术，能够在不依赖DNA双链断裂的情况下，实现对目标基因的精准编辑。该技术的核心在于使用融合了逆转录酶的Cas9 nickase（Cas9n-RT），在pegRNA引导下识别编辑位点，顺利获得Cas9n在编辑位点产生单链切口，逆转录酶利用pegRNA的模板序列在单链切口位置合成新的DNA序列，从而实现精准的基因敲入。
Bingo™技术优势
更安全
高精确性
多功能性
Bingo™实验流程
Bingo™应用案例
| 细胞名称 | HCT116 |
|---|---|
| 基因 | EGFR（Gene ID: 1956） |
| 突变位点 | c.2319_2320 ins CAC |
SpacerGCCCAGCAGGCGGCACACGTG
| Bingo™ pegRNA | Spacer | GCCCAGCAGGCGGCACACGTG |
|---|---|---|
| Extension | GTGGACAACCCCCACcacGTGTGCCGC | |
| Bingo™ gRNA | GCACcacGTGTGCCGCCTGCT | |
• HCT116细胞EGFR基因敲入（c.2319_2320 ins CAC）多克隆细胞测序结果
CRISPR/HDR基因敲入
CRISPR/HDR技术原理
CRISPR/HDR是一种依靠CRISPR系统和细胞HDR修复机制实现基因敲入的基因编辑技术。sgRNA识别并结合目标基因位点，在Cas9核酸酶的作用下切割DNA双链，含同源臂的DNA供体模板在细胞HDR修复机制的作用下，整合至sgRNA切割位点中，实现精确的基因敲入。
CRISPR/HDR技术优势
灵活性高
精准度高
CRISPR/HDR技术流程
Advantage and Characteristic
Optimazied Strategy
Optimazied Strategy
Optimazied Strategy
Optimazied Strategy
参考文献
基于CLASH技术的基因敲入策略
CLASH（Cas9-Linked Adaptor Synthesis for Homology-directed repair）技术能够在大规模细胞工程中实现高效的基因敲入。该方法结合了Cas9蛋白和适配子合成，使得在多种细胞类型中进行平行敲入成为可能。顺利获得在DNA修复过程中给予特定的适配子来提高同源重组修复（HDR）的效率，从而大大提升基因敲入的成功率。该技术展示了在细胞工程和基因编辑中的巨大潜力，特别是在需要多基因修改的复杂生物工程应用中。
顺利获得同步细胞周期来增强CRISPR介导的同源重组修复（HDR）效率
该研究探讨了顺利获得同步细胞周期来增强CRISPR介导的同源重组修复（HDR）效率的方法。使用小分子调节细胞周期，在各种细胞系中实现了1.2-1.5倍的KI效率提高。研究还展示了该方法在动物胚胎中的应用，显著提高了猪胚胎中的KI频率。这一方法顺利获得调节细胞进入有利于HDR的周期阶段，从而提高了基因敲入的成功率，为CRISPR基因编辑给予了新的优化策略。
精选客户文章
Deep whole-genome analysis of 494 hepatocellular carcinomas
全球超过一半的肝细胞癌（HCC）病例发生在中国，但现在针对中国人群中乙型肝炎病毒（HBV）相关HCC的全基因组分析研究非常有限。为了突破这种限制，研究人员启动了“中国肝癌图谱项目”（CLCA），旨在对中国人群中的HCC进行大规模的全基因组分析以理解其独特的发病机制和进化过程。该项目对494例HCC肿瘤样本进行了深度全基因组测序（平均测序深度为120×），并分析了匹配的对照血液样本，揭示了HBV相关HCC的详细基因组特征。研究发现，除了已知的编码区驱动基因（如TP53和CTNNB1）外，还存在6个新的编码区驱动基因（包括FGA）和31个非编码区驱动基因。此外，研究还揭示5种新的突变特征（包括SBS_H8），以及HBV整合形成细胞外环状DNA（ecDNA）的现象，这些ecDNA可导致癌基因扩增和表达增加。顺利获得功能验证实验，研究人员证实了FGA、PPP1R12B和KCNJ12等基因的突变能够显著影响HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这项研究结果不仅丰富了人们对HCC基因组学的理解，也为HCC的诊断和治疗给予了新的潜在靶点。
候选驱动因子概况
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肌腱损伤急性炎症期中，巨噬细胞过度激活会导致编码骨桥蛋白OPN的SPP1过表达，影响组织再生。CRISPR-Cas13由于具有RNA编辑和快速降解的能力，在组织修复方面具有巨大潜力，但缺乏合适有效的递送方法。对此，研究人员系统筛选了针对巨噬细胞的阳离子聚合物，开发了一种能够高效递送Cas13核糖核蛋白复合物（Cas13 RNP）进入巨噬细胞的纳米簇载体。顺利获得反应性氧种（ROS）响应性释放机制，该系统能够在肌腱损伤的急性炎症微环境中特异性抑制巨噬细胞中SPP1的过表达。实验结果表明，这种靶向策略显著减少了损伤诱导的SPP1产生巨噬细胞的出现，降低了成纤维细胞的激活，并减轻了肌腱周围的粘连形成。此外，该研究还揭示了SPP1顺利获得CD44/AKT信号通路促进成纤维细胞活化和迁移的机制，并顺利获得抑制这一通路有效缓解了肌腱损伤后的粘连问题。
用于PA治疗的巨噬细胞免疫微环境激活mRNA编辑策略的示意图
Electrical stimulation of piezoelectric BaTiO3 coated Ti6Al4V scaffolds promotes anti-inflammatory polarization of macrophage and bone repair via MAPK/JNK inhibition and OXPHOS activation
脊髓损伤（SCI）是一种导致感觉自主神经和运动功能的永久性损害的严重致残性疾病。干细胞疗法，尤其是间充质干细胞（MSCs），在SCI治疗中展现出巨大潜力但其再生能力有限，这限制了其在组织再生中的应用。研究团队观察到ABPCs衍生的EVs（EVsABPC）可能携带促进组织再生的生物活性信号，因此他们从鹿角芽基祖细胞（ABPCs）中提取并修饰了细胞外囊泡（EVsABPC），并将其应用于脊髓损伤（SCI）的治疗研究。研究人员发现EVsABPC能够显著增强神经干细胞（NSCs）的增殖，促进轴突生长，减少神经元凋亡，并顺利获得调节炎症反应将巨噬细胞从促炎的M1型极化为抗炎的M2型。此外，经过工程化改造的EVsABPC（顺利获得激活细胞穿透肽修饰）能够更有效地靶向SCI损伤部位，显著改善神经再生和运动功能恢复。这些结果表明，EVsABPC是一种极具潜力的SCI治疗候选方案。
图解摘要
Generation of recombinant antibodies by mammalian expression system for detecting S-metolachlor in environmental waters
S-异丙甲草胺（S-MET）是我国生产和使用量最大的除草剂之一，其化学特性导致其可在土壤中持久存在以及容易顺利获得淋溶和沉降污染地表水和地下水，最终影响植物生长和顺利获得食物链危害人类生命健康。鉴于现有检测方法的局限性和对高效分析技术的迫切需求，该研究以S-metolachlor为对象，利用哺乳动物表达系统生成相关重组抗体。在成功表达抗体的基础上，成功建立了基于这些抗体的免疫分析方法，用于监测环境水样中的S-异丙甲草胺残留。icELISA结果显示，重组抗体的灵敏度和特异性与亲本单抗相似，可保持原有的生物学活性，对于江水、农田水和自来水中的S-MET，具有良好的准确性和重复性。
图解摘要
Dumbbell probe initiated multi-rolling circle amplification assisted CRISPR/Cas12a for highly sensitive detection of clinical microRNA
微小RNA（miRNA）是一类小的非编码RNA分子，顺利获得与特定靶基因的信使RNA（mRNA）相互作用来调控基因表达。miRNA在多种疾病的发生、开展过程中扮演着重要角色，被认为是极具潜力的疾病生物标志物。该研究利用CRISPR/Cas12a开发了一种为DBmRCA的新型miRNA检测技术。该技术利用无连接酶的哑铃探针和高灵敏度的CRISPR/Cas12a信号输出策略，实现了在30分钟内对miRNA的高精度定量分析。研究团队顺利获得临床样本验证了该技术的有效性，发现miR-200a和miR-126在肺癌组织中的表达水平显著降低，且该技术与传统方法结果一致。DBmRCA技术具有时间效率高、灵敏度强和操作流程简化等优点，为临床miRNA分析给予了一种可靠的工具，有望助力肺癌的早期诊断和治疗。
图解摘要
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