更贴近人类的阿尔茨模型？APP/PS1基因敲入小鼠模型诱导Aβ沉积与神经元丢失

【文献解读】APP/PS1基因敲入小鼠模型诱导Aβ沉积与神经元丢失：更贴近人类的阿尔茨模型？

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阿尔茨海默病（AD）是一种以β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、神经元丢失和神经炎症等为特征的神经退行性疾病。现有的AD动物模型（如过表达家族性AD突变的转基因小鼠）因非生理性过表达和免疫活性背景的限制，难以真实模拟人类AD的免疫反应机制，导致临床前研究与临床试验结果脱节。因此需开发更贴近人类疾病病理和免疫特征的新型模型。

2025年2月，《Alzheimer’s & Dementia》在线发表了题为“Amyloid precursor protein and presenilin-1 knock-in immunodeficient mice exhibit intraneuronal Aβ pathology, microgliosis, and extensive neuronal loss”的研究论文。该研究由Howard E. Gendelman团队完成，研究人员顺利获得在免疫缺陷小鼠中敲入淀粉样前体蛋白（APP）和早老素-1（PS1）基因突变，成功构建了展现出神经元内β淀粉样蛋白（Aβ）沉积病理、小胶质细胞增生和广泛神经元丢失的阿尔茨海默病（AD）模型，为研究人类免疫反应在AD中的作用给予了新的工具和平台。

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文章亮点

1、新型敲入模型

首次在免疫缺陷NOG小鼠背景中构建APP/PS1双敲入小鼠，其基因的表达由内源启动子调控，避免了传统转基因模型的过表达假象。

2、神经元内Aβ病理

模型重现了AD早期神经元内Aβ沉积及其神经毒性，填补了传统模型依赖细胞外斑块为特征的不足。

3、广泛神经元丢失

模型首次在小鼠中模拟了AD患者典型的广泛神经元丢失和脑萎缩表征，突破了传统模型仅表现局部神经元损伤的局限。

4、免疫系统人源化潜力

该模型支持人类免疫细胞的重建，为研究阿尔茨海默病中人类免疫反应的影响给予了新平台。

CRISPR/Cas9基因敲入技术（CRISPR/Cas9 knock-in）是一种基于CRISPR基因编辑系统的精准基因编辑方法，顺利获得向基因组中特定位置插入或替换特定的DNA序列实现对基因组的定点修改。CRISPR/Cas9敲入技术凭借其高特异性、精准性和灵活性，已成为基因功能研究、疾病模型构建及基因治疗的核心工具。

一、KI小鼠的构建

1.基因设计

研究人员针对小鼠APP基因的外显子16，引入瑞典双突变（K670N/M671L），并部分人源化（G676R/F681Y/R684H）；同时针对小鼠PS1基因的外显子5，引入M146V突变，并人源化（I145V）。

2.CRISPR编辑

研究人员使用CRISPR Web工具设计特异性sgRNA，筛选出低脱靶风险的引导序列，从NOD雌鼠中收集受精卵。将Cas9蛋白、sgRNA与人类化供体DNA共同注射至小鼠受精卵，顺利获得同源定向修复（HDR）实现精准敲入。将编辑后的受精卵移植至假孕母鼠子宫，培育至出生。

3.基因型鉴定与纯合化

基因型鉴定：断奶时采集小鼠耳组织，顺利获得碱性裂解提取DNA。使用特异性引物进行PCR扩增目标基因片段。纯化PCR产物后进行桑格测序，确认APP和PS1突变位点及人源化序列。

纯合化：杂合子小鼠与NOG小鼠回交，筛选出纯合单敲入APP（NA）和PS1（NPS）小鼠。将NA与NPS小鼠交配，筛选纯合双敲入APP/PS1（NAPS）小鼠。

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图1 桑格测序证实了小鼠APP外显子16和PS 1外显子5中病理性突变（红框）和人源化（绿色框）核苷酸的成功替换

二、病理表型验证

1.蛋白质表达分析

Western blot检测小鼠皮质组织中FL-APP（6E10抗体）、CTF-β片段，确认突变诱导的APP异常切割。

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2.ELISA

定量可溶性与不可溶性Aβ₄₂水平，显示NAPS小鼠淀粉样负荷是NA小鼠的2倍。

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3.组织病理学

①免疫组化（IHC）进行6E10抗体染色，结果显示3月龄小鼠皮质和海马区出现细胞内Aβ沉积，并随年龄增长加重。

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②神经元丢失与脑萎缩：NeuN/MAP2染色：显示NA和NAPS小鼠皮质及海马神经元显著丢失。

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③MRI扫描：12月龄NA小鼠皮质体积减少，脑室扩张。

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④行为学测试：Y迷宫：12月龄NAPS小鼠自发交替率降低，提示空间记忆受损。

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三、人类免疫系统重建

研究人员将新生0-3天NA小鼠使用1 Gy X光辐射4h后，经肝内注射人CD34+造血干细胞（HSC）。12周后取NA小鼠和NOG对照小鼠的颊静脉血做流式细胞术验证外周血中CD45+、CD3+、CD19+等人源免疫细胞是否成功定植。

结果显示：HSC重建的NOG和NA小鼠之间没有显著差异；HSC重建未显著改变Aβ负荷。

APP/PS1.10(图2)

图2 NA小鼠人免疫重建示意图

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图3 HSC重建未显著改变Aβ负荷

总结与展望

该研究顺利获得CRISPR-Cas9敲入技术构建了免疫缺陷背景的APP/PS1敲入小鼠模型，其成功模拟了神经元内Aβ沉积、小胶质激活及广泛神经元丢失等AD核心病理特征，并具备人类免疫系统重建的潜力。尽管该小鼠模型在斑块形成和行为学缺陷方面存在局限，但其在病理机制研究和免疫治疗评估中的应用前景显著，为AD研究给予了更贴近人类的新工具。