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CRISPR那些事儿
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FAQ
为什么要进行基因过表达？
基因过表达可以帮助研究特定基因的功能，揭示其在生物体内的作用机制。它也常用于药物筛选、疫苗开发和蛋白质生产等场景中。例如，顺利获得过表达某个治疗蛋白，可以研究其在疾病模型中的治疗效果。
iPSC与胚胎干细胞（ESC）有什么区别？
iPSC与胚胎干细胞（ESC）都具有多能性，但iPSC是顺利获得重新编程体细胞取得的，而ESC来自早期胚胎。iPSC不涉及胚胎的使用，因此在伦理上被认为是一个更可接受的选择，同时它们也可以避免免疫排斥问题，因为可以根据患者的遗传背景生成。
iPSC如何帮助我们理解复杂疾病？
从患者分离出体细胞并重编程为iPCS，然后诱导分化为特定的细胞类型，用于创建疾病模型。这些模型可以帮助研究人员研究复杂疾病的发病机制，揭示疾病相关的基因和分子通路，从而有助于新的治疗方法的开发。顺利获得分析这些细胞，科学家可以观察到疾病在细胞水平上的变化，给予了疾病研究的新视角。
诱导多能干细胞（iPSC）是什么？
诱导多能干细胞（iPSC）是一类顺利获得将成体细胞重新编程为多能状态的细胞。它们具有类似于胚胎干细胞的特性，能够分化为体内的几乎所有细胞类型。这种技术允许科学家在体外生成各种细胞类型用于研究和治疗，而不需要使用胚胎干细胞。
在临床应用中，iPSCs的潜在应用有哪些？
iPSC在临床中具有广泛的应用潜力，包括用于细胞治疗（如治疗糖尿病或心脏病）、组织工程（如开发人工皮肤或肝脏组织）、以及个性化药物筛选（如根据患者特定的细胞反应来选择最佳治疗方案）。这些应用方向可能会改变治疗的方式，给予更有效和个性化的医疗服务。
EVO视讯 EVO真人生命基因载体构建的宿主菌是什么？顾客可以使用什么类型菌株来扩增质粒载体？
载体在进行扩增时，通常会使用大肠杆菌（E. coli）菌株来进行。在实验操作中，常用的大肠杆菌菌株是DH5α。DH5α适用于大多数非重组型载体。对于重组型载体，如慢病毒载体和转座子载体等，可以使用Stbl3菌株进行扩增。Stbl3是一种特殊的大肠杆菌（E. coli）菌株，来源于，HB101 E. coli strain，其基因组含有重组酶recA13突变，这可以有效地抑制长片段末端重复区的重组，从而降低错误重组的概率。
EVO视讯 EVO真人生命基因载体构建的宿主菌是什么？顾客可以使用什么类型菌株来扩增质粒载体？
载体在进行扩增时，通常会使用大肠杆菌（E. coli）菌株来进行。在实验操作中，常用的大肠杆菌菌株是DH5α。DH5α适用于大多数非重组型载体。对于重组型载体，如慢病毒载体和转座子载体等，可以使用Stbl3菌株进行扩增。Stbl3是一种特殊的大肠杆菌（E. coli）菌株，来源于，HB101 E. coli strain，其基因组含有重组酶recA13突变，这可以有效地抑制长片段末端重复区的重组，从而降低错误重组的概率。
什么是慢病毒包装？
慢病毒是一种将外源基因导入细胞的基因递送工具。顺利获得如293T等工具细胞，将带有目标DNA片段的慢病毒载体包装成具有细胞感染活性的慢病毒颗粒。这个包装过程包括：构建慢病毒载体、准备包装质粒、工具细胞培养、质粒转染、收集病毒颗粒、病毒颗粒纯化和浓缩和滴度测定等过程。
慢病毒转导后，细胞状态很差甚至出现大量死亡，如何解决？
细胞被慢病毒感染后，细胞状态不佳，这种情况有较多可能的因素导致的，以下是一些可能的原因和相应的解决方案：
1.病毒滴度过高：高滴度的慢病毒可能导致细胞毒性，使细胞无法正常生长。解决方案是降低病毒的滴度，进行一系列稀释实验，找到一个既能有效转染又不影响细胞生长的滴度
2.细胞状态不佳：感染前细胞的健康状态可能影响感染后的生长。解决方案是确保细胞在最佳状态下进行感染，例如在感染前24小时换新鲜培养基，并确保细胞密度适中
1.病毒滴度过高：高滴度的慢病毒可能导致细胞毒性，使细胞无法正常生长。解决方案是降低病毒的滴度，进行一系列稀释实验，找到一个既能有效转染又不影响细胞生长的滴度
2.细胞状态不佳：感染前细胞的健康状态可能影响感染后的生长。解决方案是确保细胞在最佳状态下进行感染，例如在感染前24小时换新鲜培养基，并确保细胞密度适中
什么是单克隆筛选，为什么它在基因编辑研究中如此重要？
单克隆筛选是从混合细胞池中分选出单个克隆，并由该克隆培养扩增成细胞系。单克隆筛选保证了使用的细胞系是来源于同一个细胞，并且确保了遗传背景的高度一致。在细胞被基因编辑或基因修饰后，初始细胞池的每个细胞的遗传背景的差异是巨大的，这样的细胞池用于后续的实验，实验结果无疑是不准确的。顺利获得单克隆筛选，可以取得遗传背景一致、具有稳定基因编辑的细胞群体，监测到的表型变化才是稳定准确的。
EVO视讯 EVO真人生命基因在单克隆筛选过程中如何确保细胞的纯度和稳定性？
EVO视讯 EVO真人生命基因采用的3D单细胞打印技术采用非接触性操作，避免了机械损伤和背景污染的问题，有助于维持细胞的完整性和生物活性。3D单细胞打印技术可以避免传统的有限稀释法分单克隆时的人为误差，保证筛选结果的可靠性。
单质粒系统和双质粒系统文库载体的区别？
单质粒系统一次转染即可完成基因编辑，构建相对简单，但质粒较大并导致
感染效率偏低；双质粒系统中，使用使用两种载体分别装载Cas9或sgRNA表达盒。先构建Cas9稳转株，然后在Cas9稳转株的基础上转染sgRNA文库。有如下优点：
1）提高编辑效率：Cas9蛋白和sgRNA在不同的载体上独立、稳定表达，可以提高编辑效率。
2）灵活性：可以根据实验需要，灵活地进行载体设计和构建。比如一个载体装载两个sgRNA表达盒。
1）提高编辑效率：Cas9蛋白和sgRNA在不同的载体上独立、稳定表达，可以提高编辑效率。
2）灵活性：可以根据实验需要，灵活地进行载体设计和构建。比如一个载体装载两个sgRNA表达盒。
如何选择合适的基因递送方式？
选择适合的基因传递系统需要根据具体实验条件、研究目的以及细胞类型等因素综合评估。定量比较各种系统的传递效率、细胞毒性和稳定性等是进一步明确选择的重要步骤。
病毒递送系统适用于需要高递送效率、基因持续表达的试验，细胞可承受较高的细胞毒性和免疫反应；如果需要较低的细胞毒性和免疫反应，并且操作简便、成本低，则选择脂质体基因传递系统。如果需要高递送效率、递送大片段DNA，且能接受较高的操作难度，基因枪基因递送系统是一个可选的方法。假如需要高递送效率，操作相对简单，且无需特殊设备，电穿孔递送系统可能是一个适合的选择。
病毒递送系统适用于需要高递送效率、基因持续表达的试验，细胞可承受较高的细胞毒性和免疫反应；如果需要较低的细胞毒性和免疫反应，并且操作简便、成本低，则选择脂质体基因传递系统。如果需要高递送效率、递送大片段DNA，且能接受较高的操作难度，基因枪基因递送系统是一个可选的方法。假如需要高递送效率，操作相对简单，且无需特殊设备，电穿孔递送系统可能是一个适合的选择。
在进行基因递送时，培养细胞需要注意哪些问题？
保持细胞培养物的活性，不要让细胞保持汇合超过24小时。解冻新细胞可以恢复转染活性。最佳的细胞铺板密度对于不同的细胞类型或应用而言是不同的，但对于贴壁细胞，转染时汇合度在70%至90%或细胞密度为5×10^5至2×10^6个悬浮细胞/ml通常会产生良好的转染结果。确保细胞在转染时未完全汇合或处于固定相。
一般CRISPR相关试剂以及Cas蛋白可以存放多久？
CRISPR检测相关试剂：
①RPA恒温扩增试剂盒于-20℃保存，可长期存放。
②靶标质粒可长期存放-20℃ ③ Cas蛋白反复冻融容易影响活性，建议分装多管，存放-80℃，根据实验需要取出使用。另外，短期内使用的，可放-20℃保存。
③crRNA容易降解，建议短时间内用不到的于-80℃保存。
④探针是DNA双链，相对来说没有那么容易降解，可放-20℃保存。
①RPA恒温扩增试剂盒于-20℃保存，可长期存放。
②靶标质粒可长期存放-20℃ ③ Cas蛋白反复冻融容易影响活性，建议分装多管，存放-80℃，根据实验需要取出使用。另外，短期内使用的，可放-20℃保存。
③crRNA容易降解，建议短时间内用不到的于-80℃保存。
④探针是DNA双链，相对来说没有那么容易降解，可放-20℃保存。
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